Mažiausioje pasaulio valstybėje Vatikane veikia ir pati mažiausia atstovybė – Lietuvos Respublikos ambasada prie Šventojo Sosto, kuri nepertraukiamai tęsė savo veiklą, net kai sovietų okupacijos metais buvo bandoma ištrinti Lietuvą iš pasaulio žemėlapio. Ambasada mažiausia laikoma dėl to, kad joje dirba tik du darbuotojai – diplomatinei misijai Romoje kas penkerius metus paskiriamas ambasadorius ir sekretorius.

Nuo 2012 m. ambasada persikėlė į nuomojamas patalpas adresu Via Giulia 66 ir jose tebeveikia iki šiol. Kaip tik tada Lietuvos diplomatinės misijos prie Šventojo Sosto vadovo pareigas pradėjo eiti meno ir bažnyčios istorikė dr. Irena Vaišvilaitė. Tai buvo pirmasis kartas, kuomet Lietuvos ambasadore prie Šv. Sosto buvo paskirta moteris. I. Vaišvilaitė ambasadoje dirbo iki 2017 m., o jos kadencijos metu vienas iš ryškiausių įvykių buvo 2013 m., kuomet Lietuva perėmė pirmininkavimą ES Tarybai.

Nuo 2017 m. iki pat 2022 m. rugpjūčio Lietuvos ambasadoriumi prie Šventojo Sosto ir Maltos ordinui buvo paskirtas diplomatas Petras Zapolskas. Atstovybės vadovo kadencija prasidėjo nuo Popiežiaus Pranciškaus vizito į Lietuvą organizavimo, kuris įvyko 2018 m. 

Ambasadoriui P. Zapolskui baigus kadenciją, darbus mažoje, bet Lietuvai itin svarbioje diplomatinėje atstovybėje perima buvusi Bažnytinio paveldo muziejaus direktorė, dailininkė ir menotyrininkė, dr. Sigita Maslauskaitė-Mažylienė. Kadangi 2025 m. paskelbti šventieji Jubiliejiniai metai, visų šalių ambasados prie Šv. Sosto bus kviečiamos prisidėti prie atstovaujamų šalių bendruomenių piligrimysčių į Romą organizavimo ir kitų kultūrinių ir religinių renginių.